Молекулярный биолог против гнилой картошки

Этот текст о том, почему болеет картошка. И ещё — как бактерии научились жить в симбиозе с плодовыми мушками, чтобы портить больше овощей и фруктов. Статью написал для «КШ» молодой учёный, молекулярный биолог Фёдор Ширшиков, поэтому из неё можно узнать не только про науку, но и про людей, работающих в этой области. 

Мало кто знает, что 2020 год был объявлен ООН Годом защиты здоровья растений. От кого нужно охранять картофель — наш второй хлеб, — и пойдёт речь в статье. Надеемся, эта история вдохновит кого-то из читателей заняться исследованием картофельных болезней.



Глава первая

Выбор темы для диссертации. — В институт приходит коллекция бактерий из гнилых овощей.

Студенческие годы я провёл в стенах Казанского федерального университета, выбрав для себя кафедру микробиологии. Затем была аспирантура в Институте биоорганической химии Российской академии наук. Коротко — ИБХ РАН. Если смотреть на здание института с высоты птичьего полёта, то оно напоминает двойную спираль ДНК. Таким задумал его наш первый директор, академик Юрий Овчинников, имя которого вместе с именем его учителя Михаила Шемякина носит институт. Архитекторы создали здесь неповторимую атмосферу — когда попадаешь в здание впервые, оно производит глубокое впечатление. Всё в институте сделано для удобства исследователей и занятий наукой.

История, о которой я хочу рассказать, началась осенью 2015 года, когда ИБХ РАН начал проект по диагностике бактериальных заболеваний картофеля. До этого я исследовал противоопухолевые рибонуклеазы из бактерий и занимался компьютерным моделированием свойств токсинов из яда скорпионов. Картошка сразу показалась мне более перспективной темой.

Вскоре коллеги-фитопатологи привезли в нашу лабораторию три огромные картонные коробки с чашками Петри, в которых находились штаммы бактерий, выделенные из гнилой картошки и других растений. Наиболее ранний штамм в привезённой коллекции был датирован 1947 годом — выделили его из подгнившей капусты где-то в Подмосковье. Иногда приходилось выделять штаммы прямо из испорченных клубней картофеля. Пахнет такая картошка своеобразно — чем-то селёдочным.

Однако далеко не все образцы оказались так называемыми чистыми культурами. В некоторых было несколько разных видов или даже родов. А какие-то штаммы просто не выжили в процессе хранения и многочисленных пересевов. Наш коллектив немало потрудился, чтобы привести эту коллекцию в порядок. Я в это время занимался созданием электронного каталога бактерий, и первая буква моего имени легла в основу сквозной нумерации штаммов (например, первый штамм получил идентификатор F001).

Глава вторая

Чёрная ножка и мокрая гниль оказываются одной и той же болезнью. — Бактерии собираются за общим столом.

Как и многие, я люблю картошку — жареную, варёную, запечённую в углях или духовке. Но чтобы картофель попал к нам на стол, очень важно, чтобы им не успели подкрепиться микроорганизмы. Поэтому основной задачей по теме моей диссертации стала разработка способа диагностики таких бактериальных болезней картофеля, как чёрная ножка и мокрая гниль. Из-за них производители теряют до 50% урожая, а иногда и больше.

Эти названия описывают два симптома одного и того же заболевания, которые проявляются в разных условиях. Когда картофель растёт в поле, то фитопатогенные бактерии могут проникнуть через корешки в сосудистую систему побега и поражённый стебель почернеет. В этом случае болезнь называют чёрной ножкой.

Фитопатогены могут быть опасны и в хранилище, куда привозят собранный урожай. Достаточно одного-двух клубней, подгнивших или даже просто заражённых в поле, чтобы несколько тонн картофеля превратились в зловонную жижу. Тогда болезнь называют уже мокрой гнилью.

Картошка нравится бактериям из-за большого количества крахмала и пектиновых веществ, которые служат для них пищей. Чтобы понять, как выглядит пектин, достаточно вспомнить варенье из груш или яблок. Желеобразную консистенцию придают варенью именно пектиновые вещества. Впрочем, микробы не делают вкусных заготовок, а предпочитают перекусить быстро и на месте. За страсть к пектину этих бактерий называют пектинолитическими или пектолитическими.

Попав в сосудистую систему растения, фитопатогены сначала должны убедиться, что они в большинстве. В этом им помогает так называемое чувство кворума. Всё почти как у людей: трапеза не начинается, пока вся семья не соберётся за столом. Если бактерий достаточно много, они выделяют в сосуды растения целый комплекс специальных белков-ферментов, предназначенных для разрушения растительной клеточной стенки. Грубо говоря, микроскопические зверюшки вскрывают упаковки и приступают к обеду.

Глава третья

Противник проникает через границу. — Петлевая изотермическая
амплификация быстро обнаруживает врага.

Диагностическая тест-система, которую я разрабатывал, позволяет определять наиболее опасные для картофеля виды бактерий из рода Dickeya. Эти микроорганизмы появились в России примерно в 2009 году — судя по всему, были завезены вместе с импортным семенным материалом. Патогены просто не заметили, поскольку система контроля семян и отечественные ГОСТы сильно отстают от современных достижений фитопатологии и способов диагностики патогенов растений.
После вторжения невидимого врага российский картофель стал больше подвержен вспышкам чёрной ножки и мокрой гнили. Если у животных и человека быстрое распространение инфекционной болезни называется эпидемией, то в случае растений говорят об эпифитотии.

Особенно страдают от таких болезней растения южных регионов России: некоторые представители рода Dickeya способны выживать при температурах до 39 °C. При такой жаре и относительно высокой влажности бактерии становятся ещё более агрессивными. Известны случаи, когда семенной картофель, выращенный в зоне с умеренным климатом и экспортированный в более тёплый российский регион, просто не доживал до осени — гнил на корню ещё в поле.

Чтобы быстро выявлять угрозу, нужно иметь надёжное средство диагностики, способное обнаружить даже малое количество патогенов. Для решения этой задачи был выбран метод петлевой изотермической амплификации (LAMP, от англ. loop-mediated isothermal amplification).

Метод этот придумали японские учёные в 2000 году. Чем-то принцип синтеза ДНК здесь напоминает оригами. Цепочки ДНК в ходе амплификации складываются с помощью ДНК-полимеразы в определённом порядке, образуя характерные одноцепочечные петли. Полимераза при этом работает при постоянной температуре 60−65 °C. Это означает, что достаточно обычного термостата, способного поддерживать такую температуру…

Не буду вдаваться в технические детали. Скажу только, что по скорости, чувствительности и специфичности LAMP превосходит классический метод ПЦР, хотя он значительно более трудоёмкий с точки зрения разработки и оптимизации тест-системы. Сегодня LAMP считается наиболее близким к идеалу методом мобильной генетической диагностики.

Кривые амплификации (вверху) и плавления продуктов LAMP-реакции (внизу), полученные с помощью амплификатора в режиме реального времени. Зелёным цветом показаны сигналы с положительного контроля, а сигналы с ДНК пектолитических бактерий — красным. Когда реакция проходит специфично, то на кривых плавления виден только один пик. Отрицательный контроль сигнала амплификации не даёт.

Хочу немного отступить от основной темы рассказа. Сегодня LAMP взяли на вооружение многие диагностические лаборатории, тестирующие людей на коронавирус. До пандемии я участвовал во многих конференциях и конкурсах на получение гранта, и никак мне не удавалось убедить экспертов, что развитие мобильной диагностики на основе метода LAMP может принести хорошую прибыль. Эта тема не прижилась даже в ИБХ РАН. Сегодня про LAMP знают все специалисты в области молекулярной диагностики, а приоритет в разработке диагностикумов у нескольких коммерческих организаций.

Диагностикум (греч. Diagnōstikos — способный распознавать) — это набор реагентов, позволяющий определить в образце инфекционный агент или мутацию в геноме.

Да и я уже работаю над темой LAMP-диагностики в одном из крупных московских стартапов. Коммерческие организации в плане развития прибыльных проектов более расторопны, чем академия или университеты. Они не боятся развиваться и привлекать для этого молодых.

Когда я начинал работать над диагностикой фитопатогенов, ещё не существовало тест-системы на основе LAMP, позволяющей определять в биологических образцах бактерий рода Dickeya. Кроме нас, как мы узнали несколько позже из научных публикаций, подобную тест-систему разрабатывала ещё группа исследователей из США. Но, запатентовав праймеры на полгода раньше, мы всё-таки оказались первыми в этом негласном соревновании. После получения патента можно было расслабиться — сесть за диссертацию и поехать на дачу сажать картошку. Но всё оказалось не так просто.

Глава четвёртая

О пользе систематики бактерий. — Обнаружение нового вида.

Повторюсь: исходно я решал задачу, связанную с молекулярной диагностикой фитопатогенов. Но исследование неожиданно повернуло в сторону уточнения систематики бактерий.

Лечение растений почти не отличается от лечения людей. Сначала пациенту-картофелю ставят диагноз, какая именно бактерия вызвала болезнь. После этого назначают лекарство. А в качестве лекарства можно использовать естественных врагов бактерий — вирусов-бактериофагов. Очень часто фаги видоспецифичны, поэтому чрезвычайно важно иметь актуальную и точную классификацию бактерий. Людей, кстати, тоже в некоторых случаях предпочтительнее лечить бактериофагами, чтобы максимально сохранить нормальную микрофлору. Достаточно сдать образец на бактериальный посев, и врач пропишет подходящий фаговый препарат.

Перед тем как запатентовать наш способ диагностики, нужно было убедиться, что он специфичен, то есть выявляет только интересующие патогены. Для этого обычно ставят диагностическую реакцию на ДНК различных бактерий точно известных видов, включая целевой. При участии коллег из Балтийского федерального университета мы секвенировали геномы 11 штаммов из нашей коллекции. Затем был достаточно длительный этап компьютерного анализа геномов наших бактерий. Полученные результаты сначала показались мне странными. Оказалось, что пять штаммов не имеют родственников среди уже известных видов и составляют уникальную группу. Среди этих «неприкаянных» оказался тот самый штамм 1947 года, а также более поздние образцы — 1993 и 2012 годов. Все эти штаммы были российскими.

Перепроверив всё несколько раз с использованием разных выборок геномов для сравнения, я пришёл к единственно возможному выводу: по всей видимости, у нас на руках новый биологический вид! Некоторые исследователи, которые ежедневно секвенируют бактерий из разных источников, утверждают, что новые виды попадаются довольно часто — достаточно зачерпнуть воды из реки, океана или взять кусочек почвы. Но всё-таки когда для открытия нового вида можно просто разобраться с тем, что уже выделено и лежит в лаборатории, то стоит постараться и «пожужжать компьютером». Да и потом, приятно оставить память о себе в области исследований, которыми занимаешься, а иначе что я день за днём делаю в институте? Это нормальный результат работы учёного.

Тем не менее далеко не все научные сотрудники готовы решиться и написать в журнал о чём-то новом. На кону их репутация. В какой-то момент учёным приходится брать на себя ответственность за появление нового таксона на древе жизни. Тогда даже ближайшее окружение не всегда оказывает поддержку. Так было и со мной. Часто приходилось спорить и стоять на своём до последнего.

Новый геномовид я назвал Pectobacterium maceratum, что отражает один из симптомов мокрой гнили, при которой наблюдается размягчение тканей клубня картофеля, или мацерация. Сегодня решением Международного комитета по систематике и таксономии бактерий новый вид окончательно утверждён.

Он называется Pectobacterium versatile, что означает «разнообразный».
Штаммы этого вида были обнаружены в самых разных уголках планеты с помощью экспериментальных методов и методов биоинформатики. Риск назвать геномы новым видом был полностью оправдан. Моя статья объёмом две странички была опубликована в журнале Genome Announcements 12 апреля 2018 года. Совпадение с Днём космонавтики оказалось весьма символичным, потому что к полётам эти бактерии всё же имеют некоторое отношение.

Глава пятая

Новый вид бактерий и плодовые мушки могут «дружить». — Почему это может быть выгодно обеим сторонам.

Мы разрабатывали способ диагностики бактерий рода Dickeya и нашли в коллекции российских штаммов новый вид. Когда-нибудь учёные и на него сделают диагностикум. Чтобы это получилось, в геноме бактерии нужно найти уникальный участок, характерный только для этого вида — своего рода видовой паспорт.

Иногда важно не только понять, есть ли в биологическом образце какой-то вид бактерии, но и определить, представляет ли он угрозу для растений, животных или человека. Обычно такие свойства тоже кодируются в геноме патогенов, как, например, гены устойчивости к антибиотикам или гены токсинов. Опасность нашего нового вида в том, что значительная часть его штаммов имеет особый ген evf.

Впервые об этом гене сообщила в начале XXI века группа французских учёных. Им удалось выяснить, что этот ген отвечает за взаимодействие бактерий и плодовых мушек — дрозофил. Эти насекомые обычно питаются подгнившими фруктами и овощами, в том числе клубнями картофеля. Бактерии мокрой гнили оказались способны инфицировать, но не убивать мушек на стадии личинок.

Эксперименты показали, что если ген evf пересадить какой-нибудь безобидной бактерии, которая обычно благополучно переваривается в кишечнике дрозофил, то такая модификация позволит бактериальной клетке выжить в пищеварительном тракте насекомого. Получается, бактерии способны оставаться в тесном взаимодействии с летающими насекомыми. Они, если можно так выразиться, научились летать. Вернее, как обычно говорят биологи — приспособились.

На сегодня обнаружено по крайней мере два вида, в которых есть ген evf. И тут нужно свести воедино два факта. Первый состоит в том, что не все штаммы нового вида обладают геном «дружбы» с дрозофилой. Второй — что такой ген есть не только у нового вида. Из этого следует, что ген evf был приобретён с помощью так называемого горизонтального переноса генов. Это особый способ передачи полезных для выживания и распространения генов между бактериями разной степени родства. Такие гены могут кодировать, опять же, гены устойчивости к антибиотикам или гены ферментов, позволяющих использовать в качестве пищи какой-нибудь новый субстрат.

Результатом переноса обычно становится так называемое селективное преимущество штамма: такие бактерии начинают быстрее размножаться и имеют больше шансов получить численное преимущество в своей или чужой экологической нише. Но гены не берутся из воздуха. Скорее всего, ген evf есть у каких-то других бактерий, например у представителей нормальной микрофлоры кишечника насекомых или почвенных микроорганизмов. Таким образом, бактериям выгодно делиться полезными генами друг с другом — это один из важных факторов их быстрой эволюции.

Но если бактерии мокрой гнили могут распространяться летающими насекомыми, недостаточно просто изолировать гнилые клубни от остального урожая или обработать картошку бактериофагами. Бактерии научились использовать мушек как средство транспорта на большие расстояния, а значит, контролировать необходимо и насекомых-переносчиков.

Зачем такое сожительство бактериям, более-менее понятно: им важно быстрее и дальше распространиться. Что же касается плодовых мушек, то, на мой взгляд, они подружились с бактериями, чтобы вместе питаться растительной пищей. Я не исключаю, что бактерии, выделяющие ферменты для усвоения растительных компонентов, могут делать то же самое и в кишечнике дрозофилы, помогая своему крылатому хозяину-сотрапезнику разрушать растительные остатки до простых сахаров. Такие сахара усваиваются намного легче. В качестве ответного жеста плодовая мушка переносит часть бактерий на новый клубень картофеля в соседнее овощехранилище.

Мне кажется, это очень простой и эффективный механизм взаимовыгодного существования бактерии и насекомого. Если вдуматься, примерно так же строятся отношения человека и молочнокислых бактерий, которые присутствуют в молочных продуктах и одновременно составляют значительную часть микрофлоры нашего кишечника.

Пока это просто гипотеза. Может, когда-нибудь я всерьёз займусь её проверкой. А может, буду заниматься совсем другой темой, не менее интересной. Мне кажется очень перспективной область молекулярной диагностики на основе амплификации. Было бы здорово придумать новый метод изотермической амплификации, который был бы прост в плане разработки новых тест-систем и надёжен в применении.

Заключение

Я не знаю, какие исследования из тех, что я проводил, пригодятся мне в будущем. Например, когда я был студентом, то изучал белковые молекулы методом построения профилей гидрофобности — на том же математическом подходе основаны способы предсказания стоимости акций на фондовых биржах. Потом была стажировка в ИБХ РАН, где я освоил базовые навыки программирования. Спустя несколько лет всё это пригодилось мне в аспирантуре для создания программы MorphoCatcher для поиска генов-мишеней при разработке диагностикумов.

Навыки могут пригодиться в любой области, и свежий взгляд на проблему очень много значит для её решения. Поэтому всем, кто хочет заниматься наукой, можно посоветовать не фокусироваться всю жизнь на одном проекте. Полезно менять темы исследований, иногда кардинально.

В заключение хотелось бы снова процитировать Юрия Анатольевича Овчинникова. Он говорил: «Наукой движет сказанное впервые». Действительно, делать что-то уникальное, чему пока нет аналогов, как-то по-особенному мотивирует, даёт силы думать и прорабатывать самые мелкие детали, которые на первый взгляд могут показаться неважными. Однако зачастую именно из таких деталей складывается невероятно красивый научный результат.

Рабочее место учёного

1. Компьютер — главный инструмент молекулярного биолога и биоинформатика. «На первом этапе исследований за ним приходилось проводить большую часть времени».
2. Подборка номеров «Кота Шрёдингера». Редакция верит, что наши материалы тоже вдохновляли Фёдора на открытие новых бактерий и другие научные подвиги.
3. Рабочий стол покрыт стеклом. «Это позволяет содержать его в чистоте».
4. Компактная центрифуга-вортекс. «На ней перемешивают размороженные реактивы перед началом работы».
5. Подборка научных статей по теме исследования. «Сейчас статей уже в три раза больше».
6. Книга Джеймса Уотсона «Избегайте скучных людей». «Это свод правил жизни в научной сфере с полезными советами для молодых учёных».
7. Научная литература по теме диссертации, книга с протоколами экспериментов и сборник статей академика Юрия Овчинникова.
8. Розетки. «Их вечно не хватает, ведь к ним подключают разные приборы. Например, ту же центрифугу или спектрофотометр для определения концентрации ДНК».
9. Набор для выделения ДНК. «Современные наборы реактивов очень удобны и позволяют быстро и качественно очистить нужное количество носителя генетической информации».
10. Колонки. «На выходных, когда в институте меньше людей, я слушал „Пинк Флойд“. А работать по выходным приходилось часто».
11. Различные лабораторные склянки.
12. Перчатки. «Важно не загрязнить образцы. Даже на чистых руках много всего, что может испортить эксперимент или реактивы».
13. Стул советских времён фирмы «Стол».

Фото: Minecraft, из архива автора статьи

Опубликовано в журнале «Кот Шрёдингера» № 3 (44) 2020 г.