Люди с молекулярными ножницами

Нобелевскую премию по химии — 2020 получили Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна за развитие метода «молекулярных ножниц» CRISPR/Cas9. Этот метод был заявлен меньше десяти лет назад, но уже стал самым популярным механизмом генетического редактирования. С помощью молекулярных ножниц сейчас создают ГМО и лечат редкие заболевания. CRISPR/Cas9 даже засветился в громком научном скандале, когда китайский учёный Хэ Цзянькуй отредактировал геном двух девочек, чтобы они стали невосприимчивы к ВИЧ. Мы попросили молодых российских исследователей, взявшихся за молекулярные ножницы, рассказать о своей работе.

«Мы создаём мутантов»

Нариман Баттулин, заведующий лабораторией генетики развития. Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

Как вы решили стать учёным?

Честнее будет сказать, что я не решил, а обнаружил себя учёным. В какой-то момент пришло осознание «ого, я стал учёным». Но помню, что в детстве я очень любил природу. Мне было интересно, как устроено живое: вот если рыбу потрошили, было интересно посмотреть, как у неё органы расположены. В какой-то момент была идея стать медиком, но потом понял, что резать по живому — не моё. Так и оказался в биологии.

Какими исследованиями занимается ваша лаборатория?

Мы смотрим, как уложена ДНК. ДНК — очень длинная молекула, чуть ли не два метра. Чтобы уместить длиннющую ДНК в крохотном ядре, приходится её особым образом укладывать: сворачивать в спирали, скатывать в клубки-глобулы, в узлы завязывать. Мы в лаборатории изучаем, как эта укладка может влиять на экспрессию генов. Что, если мы сломаем укладку? С помощью CRISPR/Cas9 мы вырезаем кусочек ДНК, ответственный за образование структур-клубочков, и смотрим, меняется ли экспрессия генов. Но пока ничего не меняется, по крайней мере в экспериментах нашей лаборатории. Может, мы немножко переоценили влияние трёхмерной структуры на экспрессию генов. А может, мышки с поломанной структурой ДНК только в лаборатории хорошо живут — в природе же всё будет плохо.

Ещё мы создаём мутантов — тоже с помощью CRISPR/Cas9. Создали, например, трансгенную мышь, которая выделяла в молоко кроветворный белок человека. Даже собрали специальный доильный аппарат и выяснили, что удой от одной лабораторной мыши — 200 микролитров молока.

В обычном стакане 200 миллилитров, а 200 микролитров — это примерно на стакан меньше.

Сейчас работаем над созданием мышиной модели для изучения коронавируса. Мышам повезло: они невосприимчивы к SARS-Cov-2, потому что рецептор ACE2, через который вирус попадает в клетку, у них другой. А мы с помощью CRISPR/Cas9 сделали так, чтобы рецептор у мышей стал похож на человеческий и мыши стали восприимчивы к вирусу. Надеюсь, получится удобная и полезная модель для вирусологов — на трансгенных мышках можно будет испытывать вакцины и лекарства.

Почему для работы вы выбрали метод молекулярных ножниц?

Любая модификация генома связана с разрезанием ДНК. Необходим соответствующий инструмент. С 1970-х годов для этого используют ферменты рестриктазы. Но в больших геномах типа человеческого их очень сложно нацелить в определённое место, а значит, рестриктазы просто искрошат весь геном. Учёным нужен был механизм, который не просто разрезает ДНК, но и делает этот разрез в конкретном месте. Прежние системы были очень громоздкие, сложные и дорогие. CRISPR/Cas9 обходится почти в 10 раз дешевле.

2012 — год, когда Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье предложили использовать для редактирования генов механизм CRISPR/Cas9.

Но и у этой системы есть недостатки. Иногда, например, может разрезать не там, где надо. А иногда — неправильно залатать брешь в ДНК. Второе гораздо опаснее, потому что довольно сложно обнаружить. У нас в лаборатории был такой случай: мы внесли в мышиный геном маленькое, точечное изменение. Но оказалось, что молекулярные ножницы заодно убрали и соседний ген. Поняли мы это только потому, что у мышек-мутантов на животе появилось белое пятно. Мы решили разобраться, откуда такая странная окраска, — и обнаружили пропажу большого куска ДНК.

Когда технология CRISPR/Cas9 окончательно созреет, в каком проекте вы бы хотели её применить?

Я большой фанат генной инженерии, и мне кажется, что даже с помощью «недозревшей» технологии учёные делают невероятные вещи. Например, есть такой способ лечения трофических язв (эти язвы появляются у больных диабетом и очень долго заживают. — КШ): на рану выпускают личинок зелёной мясной мухи. Звучит, может, не очень приятно, но эти личинки, как микрохирурги, сгрызают отмершие ткани и клетки, а живые, наоборот, не трогают. Генные инженеры усовершенствовали эти личинки, наделив их способностью выделять со слюной особый фактор, способствующий заживлению ран. И теперь трансгенные личинки не только чистят язву, но и лечат её.

Ваша любимая научная шутка?

Я преподаю генетику в университете. Поэтому одна из моих любимых шуток — картинка, мем на больную для студентов тему «когда решил в последнюю ночь подготовиться к экзамену по генетике». На огромной крыше, засыпанной снегом, стоит человек с лопатой. Он расчистил крохотный уголок, подписанный «первый закон Менделя», — это принципы передачи наследственных признаков от родителей к потомкам, основа основ классической генетики. Ну а нерасчищенные 99,9% крыши под толстым слоем снега — вся остальная генетика.

От зубастого цыплёнка к воскрешению динозавров

Дмитрий Карпов, старший научный сотрудник лаборатории регуляции внутриклеточного протеолиза. Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Как вы решили стать учёным?

Летом между 6-м и 7-м классом, пока одноклассники отдыхали, я готовился к первой в своей жизни школьной олимпиаде по биологии. Учитель разрешал пользоваться всем, что можно было найти в биологическом классе: плакатами, муляжами, коллекциями насекомых. Был в классе и микроскоп. Когда я устал рассматривать готовые препараты для микроскопа, в голову пришла необычная мысль. Я приготовил препарат на основе воды из-под цветочного горшка. В этой капле я с изумлением обнаружил микроскопическую живность! Этот день полностью перевернул моё представление о мире, и именно тогда мне захотелось изучать клеточную биологию.

Какими исследованиями занимается ваша лаборатория?

Мы изучаем внутриклеточные механизмы разрушения белков. Они нужны, чтобы клетка могла избавиться от повреждённых или мутировавших белков. Если эти механизмы сломаются, могут начатьcя проблемы: развиваются, например, нейродегенеративные заболевания вроде болезни Альцгеймера, появляются злокачественные образования.

А ещё мы занимаемся разработкой новых редакторов генома. Сердце большинства таких технологий — белок Cas9. Именно его свойства определяют безопасность и эффективность геномного редактирования. Но, к сожалению, у природного белка Cas9 есть ряд недостатков: невысокая скорость работы, большой размер и относительно низкая точность. Генетики научились её повышать, но в этом случае белки становятся менее активны. Наша цель — редакторы нового поколения, имеющие и высокую активность, и высокую точность. Кое-что нам уже удалось: мы получили несколько вариантов Cas9, чья активность сопоставима с природным белком на некоторых участках генома. Но так как на других участках активность наших вариантов Cas9 всё ещё ослаблена, мы продолжаем работу.

Почему для работы вы выбрали метод молекулярных ножниц?

Эта технология удобна по сравнению с предшествующими. Необходимо определиться только с последовательностью направляющей РНК, которая нацеливает редактор в нужное место генома. Кроме того, метод позволяет работать одновременно с несколькими мишенями: можно легко удалить часть гена, ген целиком или несколько генов.

Когда технология CRISPR/Cas9 окончательно созреет, в каком проекте вы бы хотели ёе применить?

У меня есть детская мечта по мотивам фильмов «Парк юрского периода» — попробовать возродить динозавров. Это кажется фантастикой, но есть научные данные, что курица до сих пор хранит гены древних предков — динозавров. Эти гены вполне работоспособны, и их можно активировать. Так, например, был получен зубастый цыплёнок. Ни у одной из современных птиц, кроме этого трансгенного цыплёнка, зубов нет.

Ваша любимая научная шутка?
Одна голова — хорошо, а две — мутант.

Как работают молекулярные ножницы

CRISPR/Cas — что-то вроде иммунной системы бактерий. В ДНК бактерий есть участок, CRISPR-кассета, в котором хранятся кусочки генов вирусов, которые когда-то проникали в клетку или в её предков. Бактерия регулярно пролистывает эту картотеку вирусов-преступников, считывает с неё информацию (синтезирует РНК) и затем разрезает её на отдельные генные портреты вирусов — целевые РНК. А белки Cas потом сравнивают эти портреты с проникшими в клетку молекулами и, если находят ту, что соответствует целевой РНК, то беспощадно разрезает её ДНК. Однажды учёные подумали: а почему бы не использовать CRISPR/Cas для редактирования геномов? Ведь можно собрать кусочек ДНК с геном «ножниц» Cas9 и инструкцию, какой ген или гены резать, — CRISPR-кассету. И правда, когда такую ДНК-конструкцию запускают в клетки, синтезируется комплекс CRISPR/Cas9, который начинает резать геном там, где ему повелели учёные.

Как починить генетическую поломку

Татьяна Егорова, научный сотрудник лаборатории моделирования и терапии наследственных заболеваний. Институт биологии гена РАН

Почему для работы вы выбрали метод молекулярных ножниц?

Технология довольна простая: любой молекулярный биолог может собрать вектор — конструкцию, которая донесёт гены комплекса CRISPR/Cas9 в клетку. Наверное, сыграла роль и популярность метода.

Чтобы доставить новую ДНК в клетки, учёные используют особые конструкции — векторы. Чаще всего это молекула ДНК, замкнутая в кольцо, которая несёт нужные гены. Иногда вектором становится вирус, например герпесвирус, встраивающий свою ДНК в ДНК хозяина. Клетка хозяина подвох не замечает и считывает гены вируса как свои. А учёные берут ДНК герпесвируса, убирают ненужные гены, вставляют вместо них нужные, и получатся вирусный вектор. Он встраивается в ДНК «заражённой» клетки, вносит новые гены и остаётся там навсегда.

Когда технология CRISPR/Cas9 окончательно созреет, в каком проекте вы бы хотели её применить?

Сейчас мы не можем провести генное редактирование на человеке in vivo, то есть ввести препарат живому человеку. Разрешены только эксперименты ex vivo — вне живого. Можно взять у человека клетки, отредактировать их и пересадить обратно. Так, например, уже лечат рак, анемию, синдром Хантера. Миодистрофию Дюшенна тоже можно лечить ex vivo — редактировать геном предшественников мышечных клеток и вводить их обратно пациенту. Но когда технология докажет свою безопасность, было бы здорово менять гены не порциями по клеткам, а во всём организме. Ведь нарушения происходят во всех мышцах тела — не только в тех, с помощью которых мы бегаем и прыгаем, но и в сердце, в диафрагме.

Ваша любимая научная шутка?

Когда ставишь эксперимент, то ожидаешь увидеть один результат или другой. А получаешь нередко третий. Поэтому со студенческих времён одна из моих любимых шуток — это «Вывод эксперимента: эксперимент надо повторить».

Фото: Panuwach/Shutterstock, naked-science.ru

Опубликовано в журнале «Кот Шрёдингера»#nbsp;№2 (43) 2020 г.