Свет земной, морской и подземный

Свет земной, морской и подземный

// Когда живое светится — это не чудо. Это биохимическая реакция
Авторы: Елена Клещенко («Химия и жизнь», специально для «Кота Шрёдингера»)

Зелёный огонёк светлячка, мерцающий абажур медузы, бледное свечение гнилушки... Одна из самых интригующих загадок биологии — как и почему светятся живые существа или их останки? За исследования биохимических процессов, порождающих свет, вручают Нобелевские премии. Кстати, в последние годы светящиеся организмы даже стали изготавливать генно-инженерными способами.

Он живой и светится

В сосуде произрастал гигантский светящийся гриб. <...>
— А... Вы удивлены? Это мой любимец, моя гордость! — непривычно тихим голосом сообщил нам Бубута. — Он такой умный, вы себе не представляете! Видите, господа, он начал светиться, как только мы вошли в гостиную. А ведь я не прикасался к выключателю! Он сам понимает, что нужно светить.
— Боюсь, что гриб просто ненавидит моего мужа! — шепнула мне леди Улима
.

Макс Фрай. Магахонские лисы

Поклонники Макса Фрая любят порассуждать за чашечкой камры о том, что города, по которым путешествовал сэр Макс, существуют на самом деле. Не скажем за все города с их чудесами, но светящиеся грибы вроде тех, что жители города Ехо используют в качестве светильников, существуют и в нашем мире. Однако начнём мы с более известных примеров.

Это явление было известно давным-давно. Ещё Аристотель писал о светлячках, а также о свечении рыб, гниющего мяса и древесины. Светящихся моллюсков и рыб описывал и Плиний в своей «Естественной истории». И после них многие учёные обращались к этой теме — то в философски-мистическом ключе, то просто перечисляя светящихся животных (иногда в перечень включали котов за искры из шерсти и горящие в глаза). Но первый весомый вклад в экспериментальную науку о биолюминесценции, очевидно, внёс Роберт Бойль (1626–1691), тот самый, который известен нам из школьного курса физики по закону Бойля — Мариотта.

Роберт Бойль (1626 - 1691)

Англо-ирландский натурфилософ и богослов, седьмой сын Ричарда Бойля, графа Коркского, вельможи времён Елизаветы Английской.

Во времена Бойля слова «биолюминесценция» ещё не было. Этот термин впервые использовал применительно к свечению живых существ американский зоолог Эдмунд Ньютон Харви в 1916 году.

Светящиеся бактерии, которые живут на рыбе и мясе, не гнилостные, их можно отмыть и употребить продукт в пищу. Конечно, если нет других признаков порчи... Сушёную рыбу рудокопы иногда брали в шахты в качестве источника света, если опасались взрыва: биолюминесценция гораздо безопаснее пламени.

Вывести закон, гласящий, что произведение давления газа на его объём есть величина постоянная, учёному помог воздушный насос, выкачивающий воздух из замкнутого резервуара. Но отсутствие воздуха — интересное условие и для других опытов. В 1667 году Бойль решил узнать, что произойдёт, если поместить в резервуар тлеющую головню или кусок гнилого дерева. Опыты проводили в тёмной комнате, экспериментаторы были одеты в чёрное, чтобы ничто не помешало увидеть даже очень слабый свет. Что произошло с горящей головнёй, догадаться легко. Однако и гнилое дерево, и несвежая рыба (с ней Бойль тоже экспериментировал) переставали светиться, когда воздух откачивали — когда же его впускали обратно, свечение стремительно возвращалось. Теперь-то мы знаем, что гнилушку заставляет светиться мицелий грибов, рыбу — микроорганизмы. А свет в обоих случаях — продукт реакции, которая протекает с участием кислорода. Бойль же считал, что наблюдал особое, медленное горение или же свечение фосфора.

Зарождение экспериментальной науки и путешествия натуралистов в тропические края подогревали интерес к светящимся животным. В качестве объяснения феномена предлагали фосфор и электричество — то и другое крайне занимало учёных, а белки и прочая биохимия были делом будущего. Так или иначе, люди постепенно отделяли биолюминесценцию от других видов свечения — стало ясно, что шкурка кошки не люминесцентна, а вот свечение морской воды вызвано живыми существами и ничем иным.

Фото: catalano82/flickr.com

Люциферин, носитель света

Первым шагом в изучении молекулярной природы живого света обычно называют открытие доктора медицины Рафаэля Дюбуа, опубликованное в 1885 году. Он исследовал огненосных щелкунов — очень ярко светящихся жуков Pyrophorus из Вест-Индии. Этих самых жуков, если верить «Миру животных» Игоря Акимушкина, парижские модницы носили как украшения в тюлевых мешочках, прикреплённых к платьям. У щелкунов три органа свечения: два парных вроде габаритных огней на передней спинке и ещё один, самый крупный, на брюшке.

Дюбуа измельчил светящиеся органы жуков в холодной воде и получил суспензию, свечение которой со временем угасало. При попытке приготовить экстракт в горячей воде свет погас немедленно. Но когда он смешал эти растворы — холодный и горячий, — смесь опять начала светиться. Дюбуа сделал вывод, что у жука есть вещество, которое вступает в реакцию с выделением света, и фермент, который проводит эту реакцию. Первый экстракт перестал светиться, потому что кончилось необходимое вещество — субстрат фермента, как говорят современные биохимики. Второй экстракт не светился, потому что горячая вода деактивировала уже сам фермент. Однако в первом экстракте остался активный фермент, во втором — субстрат, и когда растворы смешали, пошла реакция. Дюбуа назвал фермент люциферазой, а субстрат — люциферином (от лат. lucifer — «несущий свет»). Кстати, как раз для люциферин-люциферазной реакции и нужен кислород.

Фото: Shutterstock

Но был ещё один сложный вопрос: одинаков ли механизм биолюминесценции у разных видов? То есть когда светятся медуза, жук и бактерия — это один и тот же процесс с точки зрения биохимика или нет? Распределение способности светиться среди живых организмов казалось загадочным и как бы случайным. Учёным нравится, когда впечатляющие признаки располагаются на эволюционном древе компактно: например, почти все рыбы покрыты чешуёй, большинство птиц умеет летать.

Эдмунд Ньютон Харви

Профессор Принстонского университета, автор первых работ по биолюменесценции ракообразных. В 1920 году Харви показал различие люциферазных субстрат-ферментных систем различных таксонов.

С биолюминесценцией всё было не так: по образному выражению американского зоолога Эдмунда Ньютона Харви, «как будто написали названия групп на грифельной доске и бросили на неё горсть песка. Куда попала песчинка, там появился светящийся вид». Большая часть песка улетела в море: светятся многие медузы и кораллы, гребневики, некоторые губки, одноклеточные водоросли, моллюски, иглокожие, некоторые ракообразные. При этом наземных и пресноводных люминесцирующих животных совсем мало, и они, мягко говоря, не очень-то родственны между собой: светлячки, ещё некоторые жуки, земляные черви, многоножки, брюхоногие моллюски, а также грибы.

Прометеи, приносившие собратьям по виду холодный люминесцентный огонь, появлялись не раз, точно так же, как не один раз было изобретено крыло для полёта. А значит, на биохимическом уровне огонёк светлячка может так же отличаться от света медузы, как крыло птицы от крыла летучей мыши.

Однако долгое время все были уверены: биолюминесценция — это всегда люциферин-люциферазная реакция. К середине ХХ века стало ясно, что у неродственных видов ферменты и субстраты различаются и бактериальный люциферин, к примеру, совершенно не похож на люциферин светлячка, но принцип, предполагалось, один и тот же. Это убеждение было поколеблено в 1962 году, когда будущий лауреат Нобелевской премии Осаму Шимомура (Симомура) открыл экворин.

Фото: Shutterstock

Медуза, которая светилась не так

Биография и нобелевская лекция этого лауреата читаются как роман. Осаму Шимомура родился 27 августа 1928 года в семье военного. В сентябре 1944 года десятый класс, в котором он учился, мобилизовали на работу в арсенал морской авиации неподалёку от Нагасаки. Через два месяца арсенал был уничтожен бомбами американской авиации. Шестнадцатилетний Шимомура уцелел, был переведён на фабрику, где чинили истребители, и именно там находился утром 9 августа 1945 года, когда на Нагасаки упала атомная бомба. «В тот миг, когда я сел на своё рабочее место, в окно ворвалась мощная вспышка света. Мы ослепли секунд на тридцать. <...> Когда я ушёл с фабрики и направился домой — идти мне нужно было примерно три мили, — начался моросящий дождь. Это был чёрный дождь. Пока я добрался до дома, моя белая рубашка стала серой. Бабушка быстро приготовила мне ванну. Эта ванна, возможно, спасла меня от вредоносных эффектов радиации, которая наверняка была в чёрном дожде».

Молодому человеку, который весь десятый класс проработал на военную промышленность Японии, оказалось трудно продолжить образование. Три колледжа его не приняли, наконец удалось поступить в фармацевтическую школу Нагасаки. Временный кампус школы находился в пустом военном бараке. Шимомура окончил школу одним из лучших в выпуске (к тому времени она стала факультетом фармацевтики Университета Нагасаки) и поступил в аспирантуру в Университет Нагоя, в лабораторию Йосимасы Хираты, где занимались в том числе светящимися рачками Cypridina.

Фото: wikimedia commons

Шимомура смог очистить и кристаллизовать люциферин рачков, чтобы определить его структуру. Это было непросто. Из 2,5 кг рачков удавалось выделить около 2 мг очищенного люциферина. К тому же это вещество было крайне нестабильным, разлагалось в присутствии кислорода, и получить кристаллы не удавалось никому, даже классику и основоположнику биолюминесцентной химии Ньютону Харви. Шимомура предположил, что люциферин может кристаллизоваться в достаточно концентрированном растворе соляной кислоты, и эта идея сработала. «Когда я наконец добился успеха, я был так счастлив, что три дня не мог уснуть».

Первая статья о люциферине рачков была опубликована в 1957 году, а весной 1959-го доктор Фрэнк Джонсон из Принстонского университета пригласил Осаму Шимомуру к себе в лабораторию. Американский шеф предложил Шимомуре исследовать механизмы свечения медузы эквореи, которые в изобилии ловились на биостанции Фрайди-Харбор, принадлежащей Вашингтонскому университету. Летом 1961 года они туда отправились.

Сначала опыты были неудачными, и новый японский сотрудник предположил, что люциферин и люциферазу медузы не удаётся выделить, потому что их просто нет, а люминесценция основана на ином принципе. Но Джонсон оставался при своём мнении. «Из-за наших разногласий по поводу экспериментальных методов я начал работать в одиночку на своей стороне стола, в то время как на другой стороне доктор Джонсон и его ассистент продолжали попытки выделить люциферин. Это было очень неловкое, неудобное положение».

Фото: Shutterstock

Потом у Осаму Шимомуры появилась мысль: как бы там ни было, реакция свечения вряд ли обходится без белка, а белки чувствительны к рН раствора. Если попробовать растворы с различной кислотностью, может быть, удастся временно остановить реакцию? По крайней мере не будут впустую расходоваться нужные для свечения вещества. Вроде бы что-то начало получаться, но самое интересное произошло, когда он вылил экстракт белка в раковину. «Её внутренняя поверхность вспыхнула ярким голубым светом. В раковину выходил сток из аквариума, и я догадался, что люминесценцию вызвала морская вода» — точнее, ионы кальция, содержащиеся в ней. А значит, можно попробовать выделить искомое вещество с помощью агента, связывающего кальций. Идея сработала, и доктор Джонсон признал правоту коллеги.

Выделенный белок назвали экворином. Это был первый люминесцентный белок с механизмом действия, отличным от люциферин-люциферазного.

Фото: Shutterstock

Зелёный белок и его родственники

Вскоре Шимомура обнаружил белок, который поглощал голубое свечение экворина и испускал зелёное. Такое переизлучение называется флуоресценцией, его не следует путать с биолюминесценцией — излучением света в результате биохимической реакции. Из-за этого нового белка свет у эквореи зеленоватый, а не голубой, как принято считать; выгода в том, что зелёный свет ближе к максимуму чувствительности сетчатки потенциальных «зрителей» — рыб. Белок назвали просто green protein — зелёный белок, и это он впоследствии стал известен как green fluorescent protein (GFP). Нобелевскую премию Шимомуре принёс именно этот «побочный продукт». Выход его был ещё ниже, чем у экворина, и накопить его в достаточном количестве удалось только к 1979 году.

При детальном изучении зелёного белка обнаружилась интересная особенность. Любая люцифераза нуждается в люциферине, а, например, экворин должен присоединить к себе специальную молекулу — хромофор, чтобы дать свет. Но хромофор GFP — часть его самого, он образуется из трёх аминокислот в его составе. Значит, этот белок не нуждается ни в каких дополнительных компонентах — нужна лишь подсветка синим или ультрафиолетовым.

Осаму Шимомура больше не интересовался GFP — ведь этот белок сам не светится — и продолжал заниматься другими биолюминесцентными системами. История GFP получила продолжение более десяти лет спустя. В 1994 году Мартин Челфи ввёл участок ДНК, кодирующий GFP, в кишечную палочку и в нематоду Caenorhabditis elegans. Ко всеобщему удивлению, белок медузы нормально синтезировался и в бактерии, и в черве — нелюминесцентные организмы в синем или ультрафиолетовом свете сами начинали светиться зелёным!

Фото: Shutterstock

Потом появились и флуоресцентные позвоночные: рыбки, кролики, свиньи, собаки... Но главное — учёные получили уникальный инструмент. Если пришить ген GFP к гену какого-либо белка, клетка начнет производить белок со светящейся меткой. Можно узнать, где накапливается этот белок, как перемещается, в каких ситуациях активнее производится, — стало возможным многое, о чём раньше исследователи только мечтали. А ещё больше возможностей предложил Роджер Тсиен из Университета штата Калифорния (Сан-Диего): в его лаборатории получили мутантные формы флуоресцентных белков, излучающих свет от синего до красного. Результаты не только ценны для большой науки, но и удивительно красивы.

В итоге в 2008 году все трое — Осаму Шимомура, Мартин Челфи и Роджер Тсиен — получили Нобелевскую премию «за открытие и разработку методов использования зелёного флуоресцентного белка». Кстати, за «живой свет» Нобелевку дали и в 2014 году: Уильям Мёрнер, Эрик Бетциг и Штефан Хелль были награждены «за развитие флуоресцентной микроскопии высокого разрешения».

В иллюстрации использованы фото Shutterstock

В своей нобелевской лекции Тсиен не забыл сослаться на российских учёных под руководством Сергея Лукьянова из Института биоорганической химии РАН, которые нашли красный флуоресцентный белок DsRed в кораллах и изолировали его ген. Без этой находки коммерческие красные флуоресцентные белки не появились бы. Между тем красный свет очень хорош для исследований многоклеточных организмов — например, для локализации опухоли: кровь у большинства животных красная, поэтому наши ткани лучше пропускают излучение в красной области спектра.

Так исследования малоизвестных морских беспозвоночных изменили пути развития науки. Флуоресцентные белки из семейства GFP — одно из важнейших событий в молекулярной биологии начала XXI века. А численность экворей у Фрайди-Харбор таинственным образом уменьшилась после 1990 года — то ли из-за нефтяного загрязнения, то ли из-за каких-то неизученных экосистемных процессов. Как пишет Осаму Шимомура, там теперь трудно добыть даже несколько штук.

 

Биолюминесцентный мегагрант

В сентябре 2011 года был опубликован список учёных, получивших гранты правительства России, также известные как «мегагранты». В числе победителей оказался проект под руководством Осаму Шимомуры. Идею совместного проекта нобелевскому лауреату предложил его коллега по исследованию биолюминесценции академик РАН Иосиф Гительзон, научный руководитель Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета.

Конкурс мегагрантов проводит Министерство образования и науки РФ для поддержки научных исследований в отечественных вузах и привлечения в них ведущих учёных. Проект «Биолюминесцентные технологии» представил Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета (Красноярск). Его целью было изучение биолюминесцентных систем высших грибов и кольчатых червей. В проекте участвовали также сотрудники красноярских Института биофизики и Института физики имени Л.В. Киренского СО РАН, московского Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. 

Напомним одно из условий мегагранта: приглашённый учёный должен находиться в российском вузе, где выполняется проект, не менее четырёх месяцев. И вот пресс-конференция в России. Осаму Шимомура без особого энтузиазма отвечает на неизбежные вопросы о том, какое применение могут найти новые светящиеся белки и как они изменят жизнь каждого из нас. Раз за разом он повторяет, что лично его интересует в первую очередь фундаментальная наука, добыча нового знания. Без которой, однако, не будет и практического применения.

С фундаментальной наукой всё сложилось удачно: три статьи участников проекта опубликованы в престижном журнале Angewandte Chemie. Две посвящены люциферину червя, третья — люциферину гриба.

Светящиеся земляные черви, которыми занимались в Красноярске, — не те хорошо знакомые нам червяки, что после дождя выползают на асфальт. Это их родственники, тоже кольчатые, но миниатюрные, длиной один-два сантиметра. Когда будущий участник мегагранта Валентин Петушков ещё учился в университете, однажды ночью на биостанции он заметил в сырой земле светящиеся точки. Тогда он даже не предположил, что наблюдает неизвестный вид. А когда гораздо позднее вспомнил об этом случае, оказалось, что ни литература, ни специалисты по биологии беспозвоночных ничего не говорят о сибирских светящихся червях. Новый вид получил название Fridericia heliota. В ответ на механические, химические, электрические раздражители червь начинает светиться — вдоль тела загораются голубоватые точки и затем постепенно гаснут.

Фото: Александр Семёнов

Дальше было ещё интереснее: оказалось, что свечение фридериций имеет иную природу, нежели у любого из 12 уже известных видов люминесцентных тропических червей. В 2000-е годы Валентин Петушков и Наталья Родионова (лаборатория фотобиологии Института биофизики СО РАН) приступили к детальному исследованию этого явления. Сбор материала был ещё более трудоёмким, чем у Шимомуры и Джонсона: приходилось перерабатывать тонны почвы — жить в лаборатории черви не желали — и сортировать разнообразную почвенную фауну, отыскивая фридериций. За три года удалось собрать всего 90 г очищенной биомассы — более 50 000 червей! — а выход люциферина составил 5 мкг.

Структуру его определяли в Москве, в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН. ЯМР-спектроскопию и масс-спектроскопию выполнили Максим Дубинный и Кирилл Надеждин. Несмотря на малое количество материала, удалось определить, из каких фрагментов состоит люциферин. Но эти фрагменты могли быть соединены между собой четырьмя способами — любой из вариантов соответствовал бы результатам спектроскопии. Какой же из них правильный?

Чтобы узнать это, четыре молекулы — кандидата на роль люциферина синтезировали в пробирке. Это сделала группа синтеза природных соединений под руководством Ильи Ямпольского, тоже в ИБХ, — синтезировать проще и быстрее, чем ещё три года собирать червей. Одна из синтезированных молекул начала светиться при добавлении люциферазы червя — значит, она и совпадала с природным люциферином. Это была победа. До сих пор науке были известны семь формул люциферинов, российские учёные добавили к ним восьмую.

Фото: Александр Семёнов

Параллельно занимались грибами. Некоторые тропические виды светятся так, что видно невооружённым глазом. Мицелий обычного съедобного опёнка Armillaria mellea тоже довольно яркий — именно он заставляет светиться гнилушки, а вот свечение валуёв и сыроежек можно зарегистрировать только специальными приборами. Так или иначе, Осаму Шимомура точно оценил ситуацию: изучать биолюминесценцию грибов — дело трудное и муторное, в том числе потому, что люциферина в них очень мало. Тем, кто настроен на быстрое гарантированное получение результата, действительно лучше попытать счастья в другой области.

Российские исследователи изящно обошли эту сложность: они выяснили, что молекула-предшественник, из которой синтезируется люциферин, содержится и в несветящихся грибах, причём её там в сотни раз больше. Предшественником оказался гиспидин — вещество достаточно типичное для метаболизма грибов и растений. Его экстрагировали из чешуйчатки обыкновенной Pholiota squarrosa — этот гриб с резким вкусом одни считают съедобным, а другие ядовитым. Найти удачную схему экстракции было непросто, но в конце концов всё получилось. Гиспидина было достаточно; ферментативное окисление превращало его в оксигиспидин, то есть собственно люциферин, и после этого экстракт при взаимодействии с люциферазным экстрактом светящихся грибов начинал светиться. А это значит, что все грибы (по крайней мере все исследованные) делают это по одному и тому же принципу, ведь фермент не будет работать с «чужим» субстратом.

Таким образом, красноярские исследователи совместно с лабораториями ИБХ и японскими коллегами из Университета Нагоя смогли установить структуру ещё одного — девятого! — люциферина. Ещё одно белое пятно в наших представлениях о биолюминесценции сменилось точным знанием.

Фото: Shutterstock

Как и зачем?

История с гиспидином и оксигиспидином подсказывает ответ на важный вопрос: как могла возникнуть биолюминесценция в ходе эволюции? Сам Дарвин называл это явление трудным случаем для теории естественного отбора. Механизм биолюминесценции очень непростой, и маловероятно, чтобы все нужные компоненты возникли одновременно. А если один компонент возникает без другого, то организм будет несветящимся, и как, спрашивается, естественный отбор станет поддерживать этот признак? Но коль скоро гиспидин встречается во многих грибах и нужен им для чего-то другого, нетрудно представить, как к нему присоединилась всего одна ОН-группа, когда люциферазе «понадобился» субстрат. Впрочем, с люциферазами грибов и червей ещё предстоит разбираться.

А, кстати, зачем вообще они светятся, какая польза от этого признака? Понятно, что мигание фонариков светлячков — это коммуникация, в том числе флирт, но для чего подсветка земляному червю? Этот вопрос нуждается в изучении, но вообще-то специалисты насчитали более десятка преимуществ биолюминесценции. Это может быть и аналог предупреждающей окраски (насколько, по-вашему, вероятно, что светящийся гриб вкусен и съедобен?), и попытка испугать хищника. Или, скажем, сигнал тревоги при нападении хищника, чтобы приманить другого хищника, покрупнее, который съест первого, — в глубине океана такое случается сплошь и рядом. В самом деле, многие биолюминесцентные организмы отвечают световыми вспышками на дискомфорт. Но применительно к грибам, что бы ни утверждали жители Ехо, это не очень правдоподобно: грибу ощущать раздражение абсолютно нечем. А может быть, свет — всего лишь побочный эффект, а люциферин-люциферазная реакция или кто-то из её участников делает что-то другое, полезное для гриба?

— Эта версия была жизнеспособной до открытия механизма свечения, — говорит Илья Ямпольский. — Сейчас ясно, что он заточен именно под свечение, это основная его цель, а не побочная. А зачем оно нужно грибу, по-прежнему неясно.

Наталья Родионова иногда выкладывает в блог фотографии своей питомицы, светлячихи Лампы. Недавно Лампа отложила яйца — на ночных фото они выглядят как пятнышки зелёного света. Друзья спросили, зачем яйцам светиться: искать партнёра им явно рановато. «Не знаю зачем, — ответила Наталья.— Наверное, учатся для будущей взрослой жизни».

 

От редакции: Кстати — нам нужны светящиеся черви!

 

 

Опубликовано в журнале «Кот Шрёдингера» №10 (12) за октябрь 2015 г.